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本制品是基于荧光染料检测的即用型RPA试剂盒，可以对靶片段进行实时定量RPA分析。用户只需加入模板和引物即可进行实时定量RPA反应，具有广泛的用途。

• 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
  
• 引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到100拷贝/反应。
  
• 快捷，即用型的预配液使加样操作步骤简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
  
• 本制品规格足够100次20μL体系的染料法荧光定量RPA。

• 如果有N个样品（最好含一个样本制备阳性对照和一个样本制备阴性对照）并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个用于6点标准曲线，一个是扩增阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个扩增阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
  

  成分	N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  染料法RPA酶混合液	各1μL	各1μL	1μL
  染料法RPA反应缓冲液	各9μL	各9μL	各9μL
  自备引物1(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2(10μM)	各1μL	各1μL	1μL
  基因组DNA 或cDNA	10～100ng 或1～10ng	－	－
  自备阳性对照模板(6各梯度)	－	各1μL	－
  阴性对照模板(一般用水)	－	－	1μL
  自备50×ROX	各0.4μL/－	各0.4μL/－	0.4μL/－
  补超纯水到	20μL	20μL	20μL

  
  
• 放入荧光RPA仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考。
  

  循环步骤	反应参数	备注
  预热	39℃ 1分钟
  RPA反应 （40次循环）	39℃ 30秒	靶分子长度最好在80～200bp
  	39℃ 30秒	（采集SYBR通道的荧光信号）
  溶解曲线分析	按PCR仪器手册执行

  
  
• 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟扩增阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟扩增阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
  
• 如果两种阴性对照（样本制备阴性对照和扩增阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟扩增阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的RPA扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
  
• 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和RPA阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
  
• 对定量检测，以6个标准曲线样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
  
• 对定性检测，则得到有效Ct值的样本为阳性，无有效Ct值的为阴性。